![Preci®引物对 Preci®引物对](http://www.biotnt.com/images/_MG_0778.jpg) |
BioTNT现提供Preci®引物对
BioTNT公司精准引物产品(Precise Primer Pair)从NCBI获取全球最全最新的生物核酸序列,精确提供目标基因的SYBR® Green qPCR检测引物,备有大量库存的引物、阳性模板以及相关试剂,如定制的项目如仅需1周生成引物。 |
BioTNT全面引物产品解决方案
l
特色产品
l
经验证的Preci®引物对
l
高特异性和灵敏度:低非特异性结合的理想之选,目标基因序列的100%匹配以及最强的初始扩增信号
l
可重复的结果:严格的QC要求确保每批次都具有一致的性能
l
可靠的产品质量:公司实验室平行实验使用引物,控制引物使用风险
l
对数据充满自信:每种引物通过阳性模板验证,确认实验数据真实可靠
研究用引物
针对mRNA、microRNA、lncRNA、基因组DNA、质粒DNA提供超过20多万种引物及相关试剂
l
查看mRNA用引物
l
查看microRNA用引物
l
查看lncRNA用引物
l
查看基因组DNA、质粒DNA用引物
针对SYBR® Green
qPCR、PCR array、普通PCR、SNP、ChIP提供多用途引物及相关试剂
l
查看SYBR®
Green qPCR用引物
l
查看PCR
array用引物
l
查看普通PCR用引物
l
查看SNP用引物
l
查看ChIP用引物
定制引物产品;
拥有 30 年定制引物生产专业知识,包括基因查找比对、转录本确认、大规模引物设计、批量引物生产以及下游处理。
了解定制引物产品
l
引物浓度:2μM
l
引物包装:上游引物,下游引物各一支
l
储存温度:-20℃
配套试剂
普通PCR 和 qPCR 引物的设计原则有相同也有不同;
相同处:
• 序列的查找是一致的;
• 序列选取应在基因的保守区段;
• 选取合适的扩增片段大小
• 避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对;
• 避免引物自身形成环状发卡结构;
• Tm值在55-65℃,GC含量在40%-60%;
• 引物之间的TM相差避免超过2℃;
• 引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基;
不同处:
Real time PCR 引物
• PCR 产物长度;real-time PCR要求在300bp以内,一般首选80-150bp 之间;
• 多对目的基因同时扩增,文献上查来的引物条件会不同,需要设计尽可能条件一致的引物;
• 目的基因含量比较低时,需要设计灵敏度比较高的引物;
• 相对电泳法,Real time PCR灵敏度比较高,对引物的要求更高,引物二聚体要少;熔解曲线要求单一产物;
• Real time PCR的目的是进行定量或者相对定量,对扩增的效率有要求;对引物的二级结构要求高;
普通PCR 引物:
• 根据实验的要求不同,长度一般是从150bp到几千bp 不等;
• 对二级结构要求没有real time PCR 高;
• 对扩增效率要求不高;
• 可以选用梯度PCR 仪,选择不同退火温度,对引物退火温度要求不需要一致;
验证时不同:
引物的特异性(相同点):
Ø 引物的特异性在使用前用blast 来保证;
不同点:real time PCR
Ø 在实验结果中通过熔解曲线来验证;
Ø PCR的特异性产物峰应与引物报告中的PCR product 相差在两度之内;
普通PCR 通过产物的长度,跑条带,来鉴别产物的特异性;
Real time PCR 可以通过扩增曲线,熔解曲线分析来鉴别产物的相对量,同时也可以对终产物进行电泳分析,更全面,更科学!
BioTNT 生物技术服务部积累多年的引物设计服务经验,现推出BioTNT 引物筛选和引物设计服务。
引物筛选服务与引物设计服务的差异在于,引物筛选增加了对客户的样本验证。
客户可以选择提供样本或者不提供样本;BioTNT 设计的引物同时在客户的样本和BioTNT实验的样本上同时验证,BioTNT 出库的引物至少保证,在其中的一种模板上是工作的;
如果该引物在客户提供的模板上不能工作,BioTNT 会提供相应的质检报告,告知客户;
客户一次科研经费,可以得到BioTNT 多重的超值技术服务!
1、人/大鼠/小鼠/其他动物的mRNA 引物筛选服务
2、microRNA 引物assay订购
3、LNC RNA(long nocoding RNA) 引物筛选
4、Chip QPCR 引物筛选
5、甲基化PCR(MSP) 引物设计
6、SNP PCR(ASP) 引物设计
7、 引物设计合成服务
引物筛选和设计合成的服务具体如下:
1、人/大鼠/小鼠/其他动物的mRNA 引物筛选服务:
A. 要求,客户提供基因名称,由BioTNT 对ncbi的数据库进行查找,如果找不到序列,与客户联系后确定是否进行下一步的服务;找到序列后由BioTNT 进行引物设计和合成Page 纯化级的引物(一般设计两套两对引物);
B、客户提供CDNA 样本给BioTNT(上海市区BioTNT 可以上门取样,其他地区的样本需要客户自行解决);
C、合成的引物用客户的CDNA 样本进行验证,比较效率,,选取扩增效率比较好的一对,得到客户样本的扩增曲线和熔解曲线,制作客户的定制引物说明书;
D、分装引物,量为上游和下游各1ml(10*浓度),客户采用20ul QPCR 体系可以进行500次反应;采用10ul QPCR 体系可以进行1000次反应;
E、客户使用过程中如果不能够检测,BioTNT 提供过程中的售后服务,如重新取样进行平行实验,查找客户其他原因;建议客户使用BioTNT的PCR premix,以便得到更好的实验结果;
F、mRNA一个基因的引物筛选费用为300元;
2、microRNA 引物assay订购
A. 要求,客户提供microRNA名称,由BioTNT 对mirabase的数据库进行查找,如果找不到序列,与客户联系后确定是否进行下一步的服务;找到序列后由BioTNT 进行引物设计和合成Page 纯化级的引物(一般设计两套);客户必须至少订购一个BioTNT 成套的microRNA 试剂盒;
B、客户提供RNA 样本给BioTNT(上海市区BioTNT 可以上门取样,其他地区的样本需要客户自行解决);
C、合成的引物用客户的RNA样本进行验证,比较效率,,选取扩增效率比较好的一对,得到客户样本的扩增曲线和熔解曲线,制作客户的定制引物说明书;
D、分装引物,量为逆转录 120test,QPCR 360次,客户采用20ul QPCR 体系可以进行360次反应;
E、客户使用过程中如果不能够检测,BioTNT 提供过程中的售后服务,如重新取样进行平行实验,查找客户其他原因;客户必须使用BioTNT的成套microRNA 试剂盒,才能得到好的实验结果;
F、microRNA一个基因的引物assay 促销价格为 600元;
3、LNC RNA(long nocoding RNA) 引物筛选:
A. 要求,客户提供LncRNA名称,由BioTNT 对数据库进行查找,如果找不到序列,与客户联系后确定是否进行下一步的服务;找到序列后由BioTNT 进行引物设计和合成Page 纯化级的引物(一般设计两套两对引物);客户需要购买BioTNT premix 的试剂盒BioTNT 才会承接该项业务;
B、客户提供RNA 样本给BioTNT(上海市区BioTNT 可以上门取样,其他地区的样本需要客户自行解决);
C、合成的引物用客户的RNA样本进行验证,比较效率,选取扩增效率比较好的一对,得到客户样本的扩增曲线和熔解曲线,制作客户的定制引物说明书;
D、分装引物,量为QPCR 1000次,客户采用10ul QPCR 体系可以进行1000次反应;
E、客户使用过程中如果不能够检测,BioTNT 提供过程中的售后服务,如重新取样进行平行实验,查找客户其他原因;客户必须使用BioTNT的Premix 试剂盒,才能得到好的实验结果;
F、LncRNA一个基因的引物筛选价格为 500元;
4、Chip QPCR 引物筛选
根据客户提供的基因序列,查找启动子区,前3000bp,可以根据情况设计三套CHIP 引物;
费用为300元/套;如果设计三套,费用为900元/三套;
客户提供基因组样本,由bioTNT进行验证;
由BioTNT 进行引物分装,提供给客户。
5、甲基化PCR(MSP) 引物设计:
A. 要求,客户提供基因名称和需要检测的区段(如启动子区3000bp),由BioTNT 对数据库进行查找,如果找不到序列,与客户联系后确定是否进行下一步的服务;找到序列后由BioTNT 进行引物设计和合成Page 纯化级的引物(一般设计至少两套,四对引物);费用为:设计费500元,合成费用为1.5元/碱基。
B、提供引物干粉给客户。
C、从BioTNT 购买各品牌的甲基化检测试剂盒和premix 可以酌情减免引物设计费用,详情可向sales@biotnt.com 邮件咨询。
6、SNP PCR(ASP) 引物设计:
A. 要求,客户提供基因名称和SNP 位点,由BioTNT 对数据库进行查找,如果找不到序列,与客户联系后确定是否进行下一步的服务;找到序列后由BioTNT 进行引物设计和合成Page 纯化级的引物(一般设计至少两套,六条引物);客户需要购买BioTNT premix 的试剂盒BioTNT 才会承接该项业务(5ml 及以上);
B、提供实验条件给客户,由客户自行验证;
C、帮助客户进行分析;
D、如果购买BioTNT的mix(5ml以上);可以用优惠的价格得到该项服务(200元/位点,三条引物设计),合成费1.5元/碱基;
F、如果不购买bioTNT 的premix,SNP一个基因的引物筛选,ASP价格的设计服务价格为 500元/位点,三条引物设计,合成费1.5元/碱基。
7、 引物设计合成服务:
A. 针对mRNA, BioTNT 可以承接引物设计和合成服务,客户需要购买BioTNT premix 的试剂盒BioTNT 才会承接该项业务(5ml 及以上);
B、客户无需提供样本;序列的确认方式同引物筛选;BioTNT 针对序列,设计两套引物,设计费用暂时不收取;合成费用按照1.5元/碱基计算(按照70元/两条的平均价格计算也可);合成的引物由BioTNT 根据情况,复溶后提供客户;
C、合成的引物BioTNT 不会用客户的样本进行验证;客户自己使用后,有义务向BioTNT 提供引物使用报告;
D、分装引物,提供给客户100pmol/ul, 共20ul的量,建议客户进行1:50倍稀释后,得到2pmol/ul ,当终浓度为2uM,10ul 体系时,客户可以进行1000次反应。
E、客户使用过程中如果不能够检测,客户仍应向BioTNT 支付引物和mix的费用;客户可以向BioTNT 提供引物使用报告后,要求BioTNT 再次设计和合成引物;或者要求转为引物筛选服务(增加200元/每基因);
F、引物合成费用按照70元/两条的平均费用计算。
1、Q:引物序列什么时候提供?
A:引物序列一般是在付款后提供,提供方式见如下:
2、Q: 引物扩增的特异性如何保证?
A: 实验验证时,我们的引物一般是用tm 值来确认的;
方式:如下是我们示例的融解曲线,峰的位置是在80.4度;
这先是我们通过oligo 计算出来的理论值,也是在仪器上验证过的;
但不同仪器,不同mix 在仪器上会有所差异,一般差异不超过2度,都可能是正确的;但所有的差异都应该是同一个方向上的;
关于一般建议的验证方式顺序是:
a、TM 验证;(Biotnt 验证)
b、跑胶长度验证;(客户自己进行,请注意不要导致实验室污染)
c、测序验证(测序一般来讲,会有部分前后序列测不准,所以如果您要进行测序验证的话,产物长度一般要大于100bp)(客户自己进行)
3、Q:QPCR的引物长度一般是多少?
A: 关于扩增产物长度:biotnt 一般控制在150bp 之内;这样比较合适做QPCR,特别是两步法的扩增;
4、Q: 引物的扩增效率是多少?
A: Biotnt 引物是设计两对,我们挑选其中比较优的一对给您;
对于扩增效率,您需要自己去验证;一般扩增效率的验证有两种方法:
标准曲线法;或者是很多仪器自己有导出的;
这个我们不提供;
我们提供给您的引物,是两对引物中扩增效率比较优的一对;
简单 的delta delta CT 法,可以比较引物扩增曲线对数曲线的斜率,如果斜率平行,就可以使用delta delta CT 法进行实验和计算;
如果斜率不平行,可以使用相对定量的标准曲线法;
5、 Q: Biotnt 引物提供的浓度是多少?
A:BioTNT 为了方便客户使用,提供的引物浓度为2umol/l, 在终反应体系里是10*的浓度,即20ul 体系中,上游引物加入2ul,下游引物加入2ul。
6、Q:引物序列提供后,我如果想知道引物的特异性,该如何进行blast?
问题
|
解决
|
样本没有检测
|
核对您的样本种属和基因名称,样本种属有特异性;
|
杂乱的熔解曲线
|
检查样本内参CT 值,目的基因CT 值:如果样本内参CT 值比较高,目的基因CT 值也比较高,说明样本质量不好,建议更换样本;
如果内参CT 值正常,目的CT 值比较高,熔解曲线杂乱是正常的,说明:可能没有input 目的RNA; 更换阳性样本进行检测;
|
熔解曲线峰与BioTNT mRNA引物产品说明书中提供的tm值不一致
|
使用biotnt premix,目的产物峰应与引物说明书的Tm 相差不超过两度;如果相差比较大,说明产物不对,建议更换样本或者更换premix。
|
熔解曲线峰双峰:在目的产物峰左侧75度左右有一个产物
|
75度的峰为引物二聚体峰:CT 值大于33时,出现引物二聚体峰,是正常的;如果CT值低于33,出现引物二聚体和产物的双峰,建议更换biotnt premix 或者更换引物。
|
熔解曲线峰双峰:在目的产物峰右侧有一个产物峰
|
可能为基因组DNA 产物峰;由于biotnt 为验证过的引物(用biotnt QPCR premix验证),如果样本质量不合格,含有基因组污染,则当引物为跨外显子检测时,部分样本会在目的产物峰右侧出现一个峰(显示样本含有基因组污染),建议重新提取样本或对样本进行DNase 处理;
|
引物售后:请提供以下实验数据发送到biotnt@biotnt.com,并抄送给相应的销售;
建议客户使用引物进行实验时设定RNA阴性对照;
设定对照的方式:样本1数据(目的+内参),阴性水样本数据(目的);设定样本RNA阴性对照(样本的RNA,按照逆转录的稀释比进行稀释),同样做QPCR, 看样本是否存在该基因的基因组污染。